пцр для кошек что это такое

ПЦР-диагностика

Полимеразно-цепная реакция (ПЦР) – это одно из самых ярких достижений в сфере молекулярной биологии. Метод получил широчайшее распространение в разных областях науки. Благодаря очень высокой специфичности и чувствительности, метод ПЦР применяется в медицине, биологии, ветеринарии, криминалистике, санитарной службе и других отраслях деятельности человека.
Для анализа методом ПЦР можно использовать любые биологические материалы, которые содержат нуклеиновые кислоты (молекулу ДНК или РНК).

Принцип ПЦР- исследования

Кому мы обязаны появлением метода ПЦР?

Со слов американского биохимика Керри Мюллиса (Kary Mullis), идея идентифицировать живые организмы по короткому участку их генетического кода (ДНК) пришла ему в голову в 1983 году, по пути с работы домой. А в основе этой идеи, лежала работа другого американского биохимика, Артура Корнберга (Arthur Kornberg), которая в свое время не нашла отклика у научного сообщества.

Керри допустил возможность того, чтобы взять молекулу ДНК какого-либо организма, с помощью высокой температуры «распустить» ее спираль на две нити, специфическими маркерами-праймеры пометить уникальные для этого микроорганизма участки ДНК и затем, применив фермент ДНК-полимеразу, создать из двух нитей две новые молекулы ДНК. Но уже содержащие в себе меченные праймеры. И потом останется просто искать эти участки в диагностическом материале.

В итоге, корпорация CETUS, в которой работал Мюлис, выделила ему команду ученых. И в 1985 году, в издании Американского общества генетики человека, появилась публикация с теоретическим обоснованием ПЦР, как метода идентификации генетического материала живых организмов.

Как это все происходит в лаборатории

Выделение ДНК

Элонгация

Или синтез. После завершения процесса отжига, в реакционной смеси создают условия для активности полимеразы. Фермент, ориентируясь на молекулы праймеров (а не исходных нуклеиновых кислот), начинает синтез новых ниток ДНК/РНК. Которые становятся копиями исходных, искомых молекул нуклеиновых кислот.
Такой температурный цикл проводится 30 и более раз. В результате, даже при изначально небольшом количестве искомого генетического материала, в реакционной смеси накапливается значительное число «помеченных» праймерами нуклеиновых кислот (растет экспоненциально, с удвоением при каждом цикле).Обнаружить большие количества ДНК/РНК намного проще, за счет чего реализуется еще одно преимущество ПЦР – высочайшая чувствительность.

Детекция

Оценка результатов ПЦР проводится несколькими путями:

Преимущества методики ПЦР

Всего разработано более 10 разных методик амплификации, применяемых лабораториями в зависимости от исходных условий и поставленных целей.
Общим для них есть высокая чувствительность (для положительного результата достаточно 40 (!) или менее искомых копий ДНК в 1 мл образца, то есть вероятность ложноотрицательного ответа ничтожно мала. И очень высокая специфичность: вероятность ложноположительного ответа составляет менее 1%.
Но точность результатов сильно зависит от качества сбора диагностического материала, тщательного соблюдения всех технических требований к каждому этапу и качеству оборудования, расходных материалов (буфера, праймеров, раствора для отмывки и т.д.).

Области применения в медицине

В дерматовенерологии ПЦР используют для выявления венерических заболеваний: микоплазменной, хламидийной инфекций, сифилиса, генитального герпеса и др.
Инфекционисты активно используют ПЦР для диагностики туберкулеза, ВИЧ, вирусных гепатитов, герпеса, мононуклеоза, вируса Эпштейн-Барр и др.). А с помощью ПЦР в реальном времени, оценивая вирусную нагрузку, врачи могут составить мнение о динамике заболевания, отклике на лечение, что особенно актуально для пациентов с ВИЧ, принимающих терапию.
Также благодаря ПЦР врачи могут в течение нескольких дней с уверенностью идентифицировать коклюш и паракоклюш, выявить возбудителей эпидемии ОРВИ. Уточняются типы вируса гриппа, циркулирующие на определенной территории, на основании чего появляется возможность разработать эффективную вакцину для каждого сезона гриппа.
В течение суток или быстрее можно установить вид возбудителя кишечной инфекции, а значит – назначить адекватное лечение и обнаружить вероятный источник заражения.
Летом, ПЦР актуальна для диагностики заболеваний, передаваемых иксодовыми клещами: боррелиоза (болезни Лайма), клещевых энцефалитов.
Метод позволяет работать с любым биологическим материалом. Гемотрансмиссивные инфекции (сифилис, ВИЧ, гепатиты, боррелиоз) исследуются по пробе венозной крови или спинномозговой жидкости. Кожные болезни (герпес, грибки) – по соскобу с пораженного участка. Венерические и урологические – по образцу мочи, спермы, влагалищного отделяемого.
Так что в медицине, ПЦР применяется везде, где нужна высокая точность и быстрота получения результатов.

Лабораторные исследования, выполняющиеся методом ПЦР:

Источник

Профиль респираторных инфекций кошек ПЦР

Описание исследования

Профиль входят исследования для выявления возбудителей болезней респиратного тракта у кошек.

КОД 008 Вирусный ринотрахеит кошек (ПЦР)
КОД 013 Калицивироз кошек (ПЦР)
КОД 083 Бордетеллез (Bordetella bronchiseptica) ПЦР
КОД 090 Mycoplasma felis, Mycoplasma gateae для кошек (ПЦР)
КОД 025 Хламидиоз (ПЦР)

Требование к биоматериалу

Мазки с верхних дыхательных путей (слизистая коньюктивы глаз, носа) для исследовнаий: Вирусный ринотрахеит кошек (ПЦР) Mycoplasma felis, Mycoplasma gateae для кошек (ПЦР) Хламидиоз (ПЦР) Калицивироз кошек (ПЦР) при отсутсвии язв в ротовой полости Мазки с ротоглотки (с верхнего неба ближе к глотке) для исследований: Бордетеллез (Bordetella bronchiseptica) ПЦР Мазки из ротовй полости берется только на Калицивироз кошек (ПЦР) при наличии в ней изъязвлений. Так же возможно исследование Аутопсийного и биопсийного материал (пат. органы легкие) ВЗЯТИЕ В ПРОФИЛЬ НЕ ВХОДИТ. СКИДКИ по картам на профиль не распространяются!

Источник

Лабораторная диагностика заболеваний кошек

Лабораторная диагностика в практике ветеринарного врача необходима как один из методов правильной постановки диагноза и выявления причины заболевания

Наиболее распространенной услугой лабораторной диагностики в ветеринарии является анализ крови, который помогает определить изменения в общем состоянии животного и функциональные характеристики большинства органов и систем. Общий клинический анализ дает нам возможность определить количественное соотношение основных клеток крови. Биохимический анализ позволяет точно определить функциональное состояние органов.

Помимо исследований крови, среди лабораторных методов в ветеринарии часто выполняется анализ мочи. Общий клинический анализ мочи позволяет оценить функцию почек и других внутренних органов, а также выявить воспалительный процесс в мочевых путях. Оцениваются физико-химические свойства мочи, включающие в себя: цвет, прозрачность, плотность, рН, концентрацию белка, глюкозы, билирубина, уробилиногена, кетоновых тел, нитритов и гемоглобина. Также исследуется осадок мочи на наличие эритроцитов, лейкоцитов, эпителиальных клеток (плоский эпителий, почечный и переходный), цилиндров, бактерий, паразитов, опухолевых клеток, кристаллов и аморфных солей.

Для постановки правильного диагноза при кожных поражениях проводятся исследования соскобов с кожи, трихограммы и посевы с кожи на специальных питательных средах.

Диагностика инфекционных заболеваний кошек

На данный момент более информативным методом лабораторной диагностики инфекционных заболеваний у кошек является ПЦР, ИФА, ИХ.

Ниже приведена таблица, где указаны заболевания кошек и материал, который исследуется для подтверждения того или иного заболевания.

Источник

Новейшая информация о ретровирусных инфекциях кошек

Вирус лейкемии кошек (FeLV; ВЛК) и вирус иммунодефицита кошек (FIV; ВИК) – это ретровирусы, которые вызывают две самые важные инфекционные болезни кошек во всем мире.

Опубликованы исчерпывающие обзоры по клиническим аспектам ретровирусной инфекции 1. Различные группы экспертов также опубликовали руководящие указания по анализу на ретровирусы и лечению:

Европейский консультативный совет по болезням кошек (ABCD): руководящие указания по инфекционным болезням кошек (обновлены в 2012 г.).

Little S., Bienzle D., Carioto L., Chisholm H., O’Brien E. and Scherk M. Feline leukemia virus and feline immunodeficiency virus in Canada: recommendations for testing and management (Вирус лейкемии кошек и вирус иммунодефицита кошек в Канаде: рекомендации по анализу и лечению). Can Vet J. 2011; 52: 849–55.

Levy J., Crawford C., Hartmann K., et al. Руководящие указания по лечению ретровирусных инфекций кошек Американской ассоциации практикующих ветеринаров-фелинологов. J Feline Med Surg. 2008; 10: 300–16.

Диагностика ВИК-инфекции

Наиболее распространенным методом диагностики ВИК-инфекции является скрининг на антитела к ВИК (капсидный белок р24 или трансмембранный оболочечный белок gp40) с использованием твердофазного иммуноферментного анализа (ELISA) и иммуномиграционного экспресс-анализа (RIM).

Наборы для пациентов обычно используют в ветеринарных клиниках и приютах для животных. Скрининг на вирусный антиген невозможен, поскольку после острой стадии инфекции количество циркулирующего вируса низкое. ВИК вызывает стойкую пожизненную инфекцию, так что обнаружение антител считается достаточным для постановки диагноза.

У большинства кошек антитела к ВИК образуются в пределах 60 дней после экспозиции к вирусу, однако у некоторых кошек период до сероконверсии может быть гораздо более длительным. Ложноотрицательные результаты могут быть получены на ранних стадиях инфекции (до сероконверсии), во время терминальной фазы болезни (из-за снижения продукции антител) или при высоких вирусных нагрузках (большая часть антител связывается с вирусом).

У кошек без вакцинации против ВИК в анамнезе чувствительность и специфичность нескольких имеющихся в продаже наборов тест-полосок для пациентов высокая 2, 3.
Небольшое число кошек не продуцирует обнаружимых уровней антител после инфекции, и у этих кошек будут ложноотрицательные результаты как анализа ELISA, так и вестерн-блоттинга. Ложноположительные результаты могут быть получены при ELISA-анализе, так что рекомендованы подтверждающие анализы, особенно у кошек с низким риском инфекции.

Культура вируса признана золотым стандартом для выявления ВИК-инфекции, но не является легкодоступной. Различные наборы для пациентов, лабораторный ELISA-анализ или вестерн-блоттинг – наиболее распространенные подтверждающие анализы для серопозитивных кошек без вакцинации против ВИК в анамнезе.

У котят в возрасте до шести месяцев положительные результаты анализов на антитела к ВИК необходимо интерпретировать с осторожностью.
Котята, родившиеся от инфицированных естественным образом кошек (или кошек, вакцинированных против ВИК), могут получить антитела к ВИК с молозивом или молоком. В одном исследовании выявилось, что антитела к ВИК сохранялись после 8-недельного возраста более чем у 50% из 55 котят, родившихся у 12 вакцинированных против ВИК кошек, но больше не обнаруживались в 12-недельном возрасте 4.
Котята редко получают инфекцию от кошки, большинство котят с положительными анализами не являются действительно инфицированными, и при повторном анализе результаты будут отрицательными.

Котята в возрасте от 4 до 6 месяцев с положительными результатами анализа на антитела к ВИК, вероятнее всего, являются действительно инфицированными. Отрицательный результат анализа на антитела к ВИК обычно надежен в любом возрасте, особенно у пациентов из группы низкого риска.

Весьма соблазнительно отложить анализ на ВИК у котят до возраста более 6 месяцев. Однако у большинства результаты будут отрицательными, и этих котят можно уверенно считать неинфицированными. Хотя ВИК-инфекция у котят бывает редко, все же она встречается. Инфицированные котята, если их не выявить и не изолировать, могут быть источником инфекции для других кошек.
Приверженность владельцев животных и ветеринарных специалистов к рекомендациям по анализам на ретровирусы остается низкой, так что откладывание анализов у котят потенциально может привести к большому количеству кошек, которые вообще никогда не проходили анализов на ВИК.

Кошки, получившие вакцинацию против ВИК, продуцируют антитела, которые с помощью стандартных анализов невозможно отличить от антител, образовавшихся в результате естественной инфекции 2. Однако некоторые наборы для анализов могут надежно выявить естественную ВИК-инфекцию, независимо от наличия вакцинации в анамнезе, по-видимому, потому что они нацелены на антитела к р24 и gp40 3.
Антитела, образовавшиеся после вакцинации, могут сохраняться в течение многих лет после последнего введения вакцины, и их также получают котята, вскармливаемые вакцинированными кошками 4.

Кошек из группы риска ВИК-инфекции, таких как уличные кошки, в течение их жизни следует периодически тестировать, если они не были вакцинированы против ВИК. Также рекомендовано тестировать кошек перед вакцинацией против ВИК.

Можно использовать полимеразную цепную реакцию (ПЦР) для обнаружения генетических последовательностей РНК или ДНК (провирусной) ВИК.
ПЦР-анализы должны обнаруживать широкий спектр генетически дивергентных штаммов ВИК, чтобы быть полезными для практикующих ветеринарных врачей, а лаборатории должны поддерживать строгий контроль качества данных анализов.
Опубликованное исследование показало, что ПЦР-анализы, ранее предлагавшиеся коммерческими лабораториями, могут быть ненадежными и неправильно идентифицировать ВИК-инфицированных и неинфицированных кошек.
К настоящему времени немногие коммерчески доступные ПЦР-анализы прошли независимую оценку.

Валидированные ПЦР-анализы могут быть полезными в качестве подтверждающих анализов или для определения действительного инфицирования котят с положительными результатами анализа на антитела, однако данные анализы не следует использовать для того, чтобы определить состояние вакцинации против ВИК у кошек.

Кроме того, отрицательный результат ПЦР на ВИК не исключает инфекцию по нескольким причинам. Содержание вирусной нуклеиновой кислоты в пробе может быть ниже предела обнаружения, или проба может содержать штамм ВИК, который не обнаруживается анализом.

Источник